图1. 所用LC-SPE-NMR/MS-系统示意图。

迄今为止，未知天然物质的结构解析由于都以预先纯化为前提，因而费工、费时。本文介绍了一种自动柱后固相富集的新方法，能够对天然物质进行快速而有效的结构解析。

通常未知天然物质的结构解析都是首先将原料抽提物经过多级的色谱分离，然后运用质谱和核磁共振光谱（NMR）的方法来进行的。此时为了进行核磁共振分析采用了分级收集器对色谱峰进行截取、与流动相分离、在重氢化的溶剂中溶解，最后进行测量。特别是在分级收集之后除去流动相的时候往往出现一些问题：一是在进行分离时所用的缓冲剂和盐也同时被富集；二是包含于溶剂中的杂质也同时被浓缩。在第一种情况下可能导致所提纯的化合物分解；第二种情况下则可能使得所寻找的化合物的核磁共振与那些杂质的共振难以区别。因此这种方法仅适用于天然物质抽提液的主要和次要组分的分析。

图2. 苹果汁浓缩液的分离色谱图。

替换方案：固相材料的柱后富集法

所提出的替代方案是：将色谱与高分辨率的NMR结合，采用柱后固相提取进行富集（post column-SPE），接着将干燥的SPE管中的富集物洗脱到NMR中。与采用昂贵的重氢氧化物来代替水的传统的LC-NMR技术不同，LC-SPE-NMR可以与质子化的溶剂配合使用。这种方法的特别之处，就是排除了未知化合物中所不希望发生的叠氮化物质在质谱图中的H-D交换，否则将不可避免地导致错误的质量测定。

如果将高分辨率的质谱仪通过一个裂片集合到体系中，就可以测定准确的质量由此得出未知组分的化学总式。如果将高分辨率的质谱仪再附加一个四级质量过滤器进行离析，并配置一个碰撞池，那么除了全扫描质谱数据之外，还能准确测量在碰撞池中产生的未知化合物的碎片。通过这种方式在应用SPE干柱进行溶质富集的时候，就已经产生了关于结构方面其它的一些重要信息。

图3. 选择性全相关谱实验TOCSY，在自旋锁定时具有不同的混合时间（辐射处于糖的残部1’和1”端基异构质子以及在高场移动的糖苷配基的-CH2-组）。

苹果汁中天然物质的结构解析

针对苹果汁中所含非极性的组分，采用以苯乙烯二乙烯苯聚合物为填料的经典固相萃取方法得到了四倍的富集系数。这种样品前处理方法的优点在于：可以除掉强极性化合物如醣类或短链（脂肪）酸，而直接进样的话将会对质谱仪的离子源产生快速污染。由此得到的提取液接着被注射到HPLC柱中进行分类。将分离过程中属于未知的次要组分、位于第22min的流出液选择性地带到SPE-富集柱中进行柱后富集（图2）。通过具有质量选择性的检测器来选择性地富集质/荷比（m/z）为569.188 Th的峰。借助于将小部分的色谱洗脱物连续地导入高分辨率的飞行时间质谱仪中，从而能够获得一种极具选择性的信息并作为所提取的离子色谱图（EIC）加以利用，借此能够从其混合物中对这种未知化合物清晰地进行鉴定，并实现自动富集。

所得质谱图表明，这种假分子的离子相应于化学总式为C26H33O14，而一种碎片在m/z为275.093 Th相应于化学总式为C15H15O5（见图2）。这种小的SPE-富集柱可以借助于一种自动换柱器卡入到（HPLC）柱后的流路中。SPE-富集柱具有2mm的内径和10mm床厚。可以选用不同的固相材料，除了经典的RP-反相材料如C-8、C-18硅基材料之外，还有聚合物材料和离子交换材料。此外正相材料如纯的硅胶、氨丙基、氰基以及二醇键合相亦属此列。

图4. 用于结构解析的2D-NMR：HSQC-和 HMBC-相关性表明了介于糖和糖苷配基之间以及介于糖单元之间的键的位置。对于重要的相关性已用彩色标出。

对于极性和中等极性的溶质而言，聚合物相非常实用。为了得到色谱流需要加入四倍于后柱体积的水。通常情况下，根据在这种SPE柱上产生的保留时间允许进行多次注射来对同一峰进行多次富集（即所谓多次截留）。由此大大提高了可供NMR测量的溶质量。待色谱峰富集之后需要通入氮气以除去质子化的溶剂。经过大约30min的干燥，所有残存水和乙腈的NMR-信号便被清除干净达到可以忽略不计的程度，然后即可应用重氢化的乙腈将富集柱中的溶质淋洗到NMR-管中。其淋洗的体积约为20μl，为HPLC-柱洗出体积的十分之一以下。这一体积被一内径为1.7mm的NMR-管所接纳，该管的NMR-样品头具有大约30μl的活性体积。有别于原来所用5mm内径管和相应的600μl体积，这样可以避免强烈的稀释作用。

图3，图4显示了典型的结构解析必不可少的一维和二维NMR谱图。 特别是HSQS（异核信号量子相干性）和HMBC（异核多重价键相关性）的联合对于确定单个结构之间的键的位置能够提供极为重要的信息（见图4）。

MS和NMR能够提供未知天然物质结构方面明确的信息。此处涉及的是根皮素-2'-β-D-木糖酰（-1→<6）-β-D-葡萄糖苷（2）糖苷，该结构曾于2000年由Lommen等人在其采用LC-NMR-MS关于苹果汁提取物的研究中报道过。

后柱SPE-NMR法

后柱SPE-NMR是一种样品富集方法。涉及样品在经过分析型HPLC 的分离之后再借助固相萃取管来进行富集。 流出物在UV-检测下于“T”-型管中用通过高压泵输入的水来稀释，有关峰的流出段被转入到具有适当材料的富集管中。由于用水进行了稀释，在SPE管中的保留时间明显延长，由此可以对所分离的峰进行选择性的富集。待色谱富集完成之后，将富集管用氮气吹干，然后用重氢化的有机溶剂将其带到NMR-管中或者导入流通样品头中进行NMR测量。所有步骤包括峰的检测、富集、干燥以及最后到如NMR-管中进行测量都是自动进行的。