中国、美国、欧洲药典对HPLC方法的可调整范围

所谓药典方法，顾名思义，药典专论所收载的方法，但是否每个人都知道，药典方法考虑到各个 的差异，有一定的可调范围。下面我们具体的来探讨一下这个问题吧!

一、中国药典2020规定

0512高效液相色谱法规定如下：品种正文项下规定的色谱条件（参数）除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如 内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于33%时，允许改变范围为0.7X〜1.3X;当X大于33%时，允许改变范围为X—10%〜X+10%。由上文可知，中国药典专论方法除填充剂种类、流动相组分（比例调整在规定范围内）、检测器类型不得改变外，其他条件改变了，还是认为是药典方法。但中国药典没有规定方法确认之说，所以，即使是中国药典方法，也是应该按分析方法验证的相关规定进行全套的方法验证。

二、美国药典规定

USP43<621>CHROMATOGRAPHY规定如下：为符合系统适用性的要求而调整的操作条件是允许的，除非专论项下另有规定，下面为所列的最大的可调范围，这些调整需要额外的确认数据。为确认新条件对方法的适用性，评估调整对相关分析性能特征存在的潜在影响。多条件的调整，将对系统性能产生累积影响，实施前需仔细考虑。1、流动相缓冲液的pH（HPLC）:±0.2单位以内或规定范围以内调节，适用梯度及等度。

2、流动相缓冲液盐浓度（HPLC）：±10%（pH允许情况下），适用梯度及等度。

3、流动相中组分比例（HPLC）：组分比例≤50%的组分可以相对调节±30%，但是任意一组分比例的调节不应超过±10%（相对于总的流动相），含三组分的流动相的调节可以分组分进行，含双组分的流动相的调节可在最小的组分进行，双组份和三组分的调节实例如下：双组分：例如流动相50:50，其中一组分50%的30%是15%，但是它超过了占总体比例±10%的规定，所以这个流动相比例的调节范围应以±10%为限，可以在不超过40:60~60:40的范围之间调节。再例如流动相比例为2:98，其中小组分2%的30%是0.6%，这个值不超过占总体比例±10%的规定，此流动相的比例可以在不超过1.4:98.6~2.6:97.4的范围之间调节。三组分：例如流动相60:35:5，它的次组分35%的30%是10.5%，但是它超过了占总体比例±10%的规定，所以这个流动相比例中的次组分的调节范围应以±10%为限。对于最小组分5%的30%是1.5%。可以在不超过50:45:5~70:25:5或58.5:35:6.5~61.5:35:3.5的范围之间调节。

4、紫外检测器的波长（HPLC）:专论中规定的检测波长不允许改变，检测器供应商的程序或另一个验证程序来说明，波长检测误差，最多不得超过±3nm。

5、固定相

长度(GC):可以在±70%范围内调节。

长度(HPLC):见粒径项下。

内径(HPLC):如果线速度保持恒定，可以调整。见HPLC流速。

内径(GC):最大可调整至±50%。

膜厚(毛细管柱GC):最大可在−50%至100%调整。

6、粒径(HPLC):等度洗脱：粒径和柱长均可以修改，但柱长（L）与粒径（dp）的比值（L/dp）恒定或在规定柱长与粒径的比值的-25%~+50%范围内。或者（对于将粒度调节应用于表面多孔颗粒时），其它柱长（L）和粒度（dp）的柱子可以使用，但理论塔板数（N）应在规定柱的-25%~+50%范围内。如果调节导致更高的理论塔板数时应注意，这样将产生更小的峰体积，应通过缩小额外柱外峰拓宽的因素调整，例如仪器的管路、检测池的体积、采样速率和进样体积。当专论中未规定粒度时，该比值应采用规定柱的最大粒度计算。

7、粒径(GC):如果色谱图的符合系统适用性要求以及粒径范围比相同，粒度大小可以从大变小或从小变大，粒径范围比的定义是最大粒度直径除以最小粒度直径。

8、流速(GC):流速可以最大在±50%调整。

9、流速(HPLC)：当粒度改变时，流速也许需要调整，因为为达到相同的性能，小粒度的柱子需要更高的线速度（测量通过较少塔板高度），流速、柱内径、粒度通过下面公式换算。

F₂=F₁×[(dc₂²×dp₁)/(dc₁²×dp₂)]

其中：

对于等度洗脱，如果粒度从≥3μm变化到＜3μm时，将增加线速度（通过调整流速），如果柱效不下跌20%以上，相同地，如果粒度从＜3μm变化到≥3μm时，应减少线速度（流速）来避免柱效降低20%以上。梯度洗脱：流速、柱内径、粒度将不允许调整。另外，流速可以在±50%调整。（只适用于等度洗脱）

三、欧洲药典10.0规定

EP10.0  2.2.46Chromatographic Separation Techniques规定如下：

1、液相色谱-等度洗脱：小组分的数量可以在相对±30%或绝对±2%范围内调节，两者取其大。

（2）流动相中水相组分的pH：除非专论中另有规定，用于配制流动相的pH可以在规定的值或范围的±0.2以内调节。如果待测品为非电离物质（中性物质），pH可在±1.0范围内调节。

（3）流动相中缓冲液盐浓度：用于配制流动相的含水缓冲液的盐的浓度可在±10%范围内调节。

（4）流速：一般调节范围为±50%，若柱尺寸改变了，流速可以更大范围内调节，具体可按下述公式来计算。

（5） 参数：

固定相：固定相的属性不能改变（例如：不能用C8来代替C18）；

粒径：最多可减小50%，不允许增加。

长度:可以±70%范围内调节。

内径：可在±25%范围内调节。

当柱的尺寸改变时，流速通过下面公式进行调节。

F₂=F₁×[(l₂×d₂²)/(l₁×d₁²)]其中：

（6）柱温：除另有规定，可以在规定柱温±10℃范围内调节，。

（7）检测波长：不允许改变。

（8）进样体积：若待检峰的灵敏度和重复性好的话可以减小，不允许提高。

2、液相色谱-梯度洗脱梯度洗脱的液相条件调节需比等度洗脱的更加慎重。流动相的组成/梯度洗脱可以在符合下述条件的前提下进行小范围的调节：满足系统适应性的条件；主峰的出峰时间在原定保留时间的±15%以内；流动相中最终组分的洗脱能力的强度不得弱于原规定组分；如果系统适应性的条件达不到，则通常首选考虑滞留体积或更换柱子。

（1）滞留体积（死体积）：仪器的结构将会大大的改变分离度、保留时间、相对保留时间，如果这些发生，是由于滞留体积过多。专论中通常在梯度洗脱时先进行等度洗脱。考虑到方法开发系统和实际系统的滞留体积的不同，所以梯度洗脱的时间应该足够。所以使用者在进行方法确认时应确认等度洗脱的时间。如果洗脱时的滞留体积在专论中有规定，则开始洗脱的时间点（tmin）应该被调节时间点(tcmin)替代。用下面公式计算

式中：D：滞留体积，ml；D0：方法开发时的滞留体积，ml；F：流速ml/min。如果方法的验证没有包括该步骤，用于上述目的的等度的描述可以被省略。

（2）流动相中缓冲液的pH：不允许调节。

（3）流动相中缓冲液盐的浓度：不允许调节。

（4）流速：当柱子的内径改变时，调节是可以接受的，具体见流速公式。

（5）柱参数

固定相：固定相的属性不能改变（例如：不能用C8来代替C18）；

粒径，不允许调节。

长度：长度可以±70%范围内调节。

内径：可在±25%范围内调节。

当柱的尺寸改变时，流速按照下面的公式进行计算并调节。

F₂=F₁×[(l₂×d₂²)/(l₁×d₁²)]其中：

（6）柱温：除另有规定外，温度可在标准规定温度±5℃范围内调节。

（7）检测波长：不允许改变。

（8）进样体积：若待检峰的灵敏度和重复性可满足的话可以减小，不允许提高。

3、气相色谱

（1）柱参数

固定相粒径：粒径最多可减少50%，不允许增加（填充柱）。

膜厚：可以在-50%~+100%范围内调节（毛细管柱）。

长度： 长度可以±70%范围内调节。

内径：可以在±50%范围内调节。

（2）流速（GC）：可以在±50%范围内调节。

（3）柱温（GC）：可以在±10%范围内调节。

（4）进样体积和分流比：若待检峰的灵敏度和重复性可以满足的话，可以调节。

USP与EP规定的可调范围基本一致，相较于梯度洗脱，EP药典更加谨慎，基本上不允许进行过多的调整。此外药典方法，EP与USP均要求进行方法确认，并且明确指出，药典方法可以不进行全套的验证。