干货分享| 酚氯仿法提取基因组DNA

赵桂芝 0 2022-01-14

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提取细胞、组织的DNA进行PCR实验属于细胞分子实验的必备技能，现在各公司也开发了适用于各类样本的DNA提取试剂盒，省时省力。酚氯仿这种经典的实验方法正在被取代，但对于科研经费不是比较充足的，可能更愿意使用这种经典方法，从而使经费花在关键实验上。今天就为大家整理了该实验方法涉及到的一些内容。

实验目的

使用传统的提取DNA的方法，可以获得纯度较高、产量较大的基因组DNA，为后续的PCR反应提供较佳的模板。该方法具有普遍适用性，但相对耗时，且用到多种有机溶剂，对实验操作人员的健康威胁较大。

实验原理

EDTA（乙二胺四乙酸），一种金属离子螯合剂。原因是细胞内有金属离子，如Mg2+，是酶活性的辅助因子，会使DNA被DNase分解，故除去使DNase活动的Mg2+以保护DNA不被变性或降解。SDS（十二烷基磺酸钠）将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解,使 DNA从核蛋白中游离出来，同时SDS可以迅速破坏组织结构，抑制RNase和脱氧核糖核苷酶（DNase）活性。蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解，蛋白酶K的作用是使膜蛋白降解，使与DNA结合的蛋白质降解，使DNA充分游离。蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力。β-巯基乙醇可以打断多酚氧化酶的二硫键，保护酚类物质不被氧化，从而保护核酸不被降解。苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。在抽提DNA时，为了均匀混合，必须剧烈震荡，在酚氯仿中加入少量异戊醇，可以减少抽提过程中泡沫的产生，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。（苯酚相对密度：1.07，氯仿相对密度：1.49）。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层（有机相）,DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。异丙醇或无水乙醇等会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合，沉淀DNA；回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，干燥后用蒸馏水或TE缓冲液（Tris和EDTA配置而成）溶解DNA备用。

操作流程

1、将组织或细胞置于1.5ml EP管中，加入500μl的裂解缓冲液（Lysis Buffer）、5μl β-巯基乙醇和20-50μl 蛋白酶K (Proteinase K)，56℃水浴2-16h；

2、加入700μl DNA提取液（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1）下层溶液，颠倒充分混匀，9000 rpm，4℃离心15min；

3、取上清，加入双倍体积的异丙醇（Isopropanol，Dimethylcarbinol），颠倒轻缓混匀，冰上或-20℃冰箱静置10min，12000 rpm，4℃离心10min；

4、弃上清，留白色沉淀，加入1ml遇冷的70%乙醇（Ethanol，Ethyl alcohol），颠倒轻缓混匀，12000 rpm，4 ℃离心5 min；

5、重复上一步；

6、弃上清，留白色沉淀，晾干残留乙醇，加入适当体积的ddH2O，用超微量紫外分光光度计测量浓度。

溶液配制

注意事项

1、实验操作中的离心速度和时间可根据经验做出调整，方法中的转速和时间可做基础参考；

2、试剂使用中β-巯基乙醇也可以用DTT替换，异丙醇可用无水乙醇替换；

3、苯酚-氯仿是除蛋白的，所以要充分震荡混匀使蛋白变性，但又不能太剧烈而打断DNA；

4、离心后要避免再次吸入有机相的苯酚-氯仿，尽量只取上清。如果吸取的上清中混杂了蛋白质层和有机相，需要用DNA提取液再次抽提；

5、提取的DNA如果需要进行测序，或避免离子干扰的实验，建议使用蒸馏水溶解DNA而非TE缓冲液。

相关问题

1、抽提DNA用苯酚、氯仿混合液还是单独使用？

酚和氯仿都是非极性分子，而水是极性分子，酚的变性作用比氯仿强，但酚和水相相对水平的互溶，约10%到15%的水会溶解于酚相中，因此丢失了这部分水相中的DNA。虽然氯仿的变性作用没有酚那么好，但氯仿不会和水相互混溶，作用是战胜酚的缺陷，加快有机相与液相的分层，最后用氯仿抽提出DNA。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第2次变性蛋白质，将酚一同带走。

由于酚易溶于氯仿中，可以快速去掉核酸溶液中的少量酚。因此在蛋白水溶液中加入氯仿-酚混合液充分混匀时，氯仿可以挤掉蛋白质和蛋白质分子间的水分子，使蛋白失掉水合情况而变性，并且可以挤掉残留在酚中的水分子，在离心后可以使各相获得较好的分离，并且可以节约相应的实验操作时间。

也可以在酚-氯仿混合液中加入少量的异戊醇，加入的异戊醇能减小分子表面张力，因而能减少抽提流程中的泡沫发生。通常选用酚-氯仿-异戊醇的比例为25：24：1，这是因为异戊醇可以帮助分相，使离心后的上层水相，下层有机溶剂相，中层变性蛋白相保持稳定的层次。

2、乙醇和异丙醇沉淀DNA的区别

异丙醇和酒精都是有机溶剂，异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效，沉淀的效果较佳。但易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。

乙醇的极性要强于异丙醇，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。DNA沉淀中所含的微量乙醇易蒸发去除，不影响后续实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的无水乙醇可有效沉淀DNA。

责任编辑：展源

审　　核：何发

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