依据

通则2351真菌毒素测定法

GENERAL CHAPTERS<561>

ARTICLES OF BOTANICAL ORIGIN

2.8.18 DETERMINATION OF AFLATOXIN B1 IN HERBAL DRUGS

方法

第一法

HPLC法

TLC法

HPLC法

第二法

HPLC-MS法

薄层扫描法

第三法

酶联免疫法

HPLC法

限度

每1000g含黄曲霉毒素B1不得过5µg ，总量不得过 10µg。

每1000g含黄曲霉毒素B1不得过5µg，总量不得过20µg。

每1000g含黄曲霉毒素B1不得过2µg，总量不得过4µg。

说明

中国药典的三种方法都可以使用，当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。

首先使用第一法，第一法系统适用性不通过才会使用第二法或第三法。

只有一种方法，适用于devil’s claw root, ginger and senna   pods，用于其他品种需要验证适用性。

十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂

流动相

甲醇-乙腈-水(40 : 18 : 42)

流速

1.0ml/min

柱后衍生化

光化学衍生器（254nm）

检测器

荧光检测器，激发波长360nm (或365nm)，发射波长450nm。

系统适用性

两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5；需确认回收率应在60~120%，线性回归的相关系数应不低于0.990；

混合对照品溶液

精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 标示浓度分别为 1.0µg/ml、0. 3µg/ml、l.0µg/ml、0.3µg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液l ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

供试品溶液

取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml, 高速搅拌2 分钟（搅拌速度大于11000 r/min），离心 5 分钟（离心速度4000r/min），精密量取上清液15ml, 置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心 10分钟（离心速度4000r/min)，精密量取上清液20ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml, 用水20ml洗脱(必要时可以先用淋洗缓冲液10ml洗脱，再用水10ml洗脱），弃去洗脱液，使空气进人柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱, 收集洗脱液，置 2ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0. 22µm)滤过，取续滤液，即得。

进样量

混合对照品溶液5µ1、10µ1、15µ1、20µ1、25µ1；供试品溶液20~50µl。

定量方法

测定各对照品溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线；测定供试品溶液的峰面积，从标准曲线上读出供试品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，并计算出四者总和。

4.6-mm×15   cm，3-µm填料L1（即十八烷基硅烷键合硅胶）

流动相

水-甲醇-乙腈（60:25:15）

流速

0.8   mL/min

检测器

荧光检测器，激发波长362nm，发射波长440nm

系统适用性

洗脱顺序为AFG2、AFG1、AFB2和AFB1；

将5号线性对照溶液5ml加入到5g的样品中，按“供试品溶液”（甲醇-0.5%碳酸氢钠（7:3）用量为20ml）处理方法，计算AFB1（2μg/kg）和黄曲霉毒素（5μg/kg）的平均回收率，应分别不低于68%和70%。AFB1和黄曲霉毒素总量的相对标准偏差（RSD）不高于10%。

免疫亲和柱预处理

免疫黄曲霉素柱的总黄曲霉毒素最小容量不低于100ng。将AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每个5ng，溶于10mL 10%甲醇的磷酸盐缓冲盐溶液（v/v）中时，各回收率不低于80%。

对照品溶液

用乙腈制备AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别含有2.0、0.50、2.0和0.50μg/ml的混合对照溶液。首先用乙腈制备标示浓度均为10μg/ml的各储备液，在360nm附近测定最大吸光度，计算公式为：黄曲霉毒素浓度（μg/ml）=（A×Mr×1000）/ε，其中A为吸光度，Mr为分子量，ε为摩尔吸收系数，见附表1。准确量取一定量黄曲霉毒素各储备液至同一容量瓶，用乙腈稀释至规定浓度。冰箱储存，使用前平衡至室温。用甲醇-水（1:1）稀释黄曲霉素对照溶液，最终浓度见附表2。冰箱保存，使用前平衡至室温，每日新制。

供试品溶液

取样品5g，置于50ml离心管中，加入氯化钠1 g和甲醇-0.5%碳酸氢钠（7:3）25 mL。在涡流混合器上混合，直到样品颗粒和提取溶剂充分混合，400 rpm振摇10min，7000 rpm离心10min，立即取7 mL至50 mL离心管中，加入0.1 M磷酸盐缓冲溶液28 mL，混合，过滤，收集25ml滤液（相当于1g样品）到25ml刻度量筒中，并立即上IAC柱。[注：对于IAC柱在使用前必须在室温下至少平衡15分钟。]从小柱上取下顶盖，并将其与储液罐连接。从柱上拆下端盖，并将其连接到柱歧管上（必须拧紧）。让柱中的液体通过，直到液体高出柱床约2~3 mm。将滤液25ml倒入储液罐。让液体自然流过柱子，让柱子流干。为了便于再次开始流动，从歧管上取下 ，向柱中加入磷酸盐缓冲盐溶液约2 mL，将 重新连接到储液罐上，然后用磷酸盐缓冲盐溶液3ml和水5ml清洗 （如果使用其他技术去除柱末端的气泡并很容易重新开始流动，则可将磷酸盐缓冲盐溶液5ml直接加入到柱储液罐中）。让柱子流干，然后用注射器注入3ml空气通过柱子，用甲醇1ml洗脱，并用3ml容量瓶中收集洗脱液，使洗脱液自由滴落。让柱子流干。静置1分钟，然后用额外的甲醇1ml洗脱，并收集在同一容量瓶中。让柱子流干，并注入10ml空气通过柱子，用水稀释洗脱液至刻度，立即进行分析。

进样量

50µ1

定量方法

毒素（µg/kg）={[（R−a）/S]×V/W}×F

R=样品溶液的峰面积；a=校准曲线的y截距；S=校准曲线的斜率；V=样品溶液的最终体积（mL）；W=通过免疫柱的供试品1g；F=稀释系数，V=3 mL时为1；黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的总和。

柱长0.25m，直径4.6mm，十八烷基硅烷键合硅胶为固定相（5-µm）

流动相

乙腈-甲醇-水(2:3:6)

流速

1.0ml/min

柱后衍生化

光化学衍生器（254nm）

检测器

荧光检测器检测，激发波长= 365nm，发射波长Aem =435nm。

系统适用性

出峰顺序：G2、G1、B2、B1；需满足验证要求。

对照品溶液

用甲苯-乙腈(98:2)制备10µg/mLAFB1贮备溶液，并在330nm~370nm波长范围内测定吸收曲线，计算公式为：黄曲霉毒素浓度（µg/mL）=（A×M×100）/ε，其中A为紫外吸收曲线上的最大吸光度，M为B1的分子量（312g/mol），ε为摩尔吸收系数（1930m2/mol）。用甲苯-乙腈(98:2)将初级贮备液稀释为100ng/mL的次级贮备液，用铝箔紧密包好后，置于4℃储存，使用前，待溶液恢复至室温后才能取下铝箔。使用前后记录容量瓶的重量。按附表3制备系列对照溶液，将所需体积的次级贮备液置于250ml容量瓶中，氮气吹干，加入甲醇75ml溶解黄曲霉毒素B1，并用水稀释至刻度。

免疫亲和柱预处理

免疫亲和柱对黄曲霉毒素B1的容量不低于100 ng。将AFB1 5 ng，溶于12.5ml甲醇和87.5 mL 水中时，回收率不低于80%。使用前平衡至室温。

供试品溶液

取本品粉末5.00g，加入甲醇:水(70:30)混合溶液100ml，超声处理30min，取滤液10ml至150ml锥形瓶，并加入水70ml。取40ml以流速3ml/min（不得超过5ml/min）通过免疫亲和柱。用水以流速5ml/min冲洗小柱两次，每次10ml.用注射器注入空气10s。取甲醇5ml注入小柱，并保持自然流出，收集洗脱液至5ml容量瓶中，1min后，注入甲醇0.5ml ，再隔1min后，注入甲醇0.5ml，每次加入甲醇后，均通过注入空气收集洗脱液，用水稀释至容量瓶刻度，摇匀。溶液澄清的话，可直接用于分析；否则应过滤处理，并确保黄曲霉毒素没有损失。

进样量

500µ1

定量方法

用黄曲霉毒素B1系列对照溶液1~5做标准曲线，样品浓度超出线性范围，则需要做相应稀释。

毒素（µg/kg）=[（R−b）/a]×V /W

R=样品溶液的峰面积；b=校准曲线的截距；a=校准曲线的斜率；V稀释倍数；W=通过免疫柱的供试品g；黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的总和。

AFB1

312

乙腈

20700

AFB2

314

乙腈

22500

AFG1

328

乙腈

17600

AFG2

33

乙腈

18900

AFB1

AFB2

AFG1

AFG2

总和

1

0

0

0

0

0

0

2

12.5

0.25

0.0625

0.25

0.0625

0.625

3

25

0.5

0.125

0.5

0.125

1.25

4

50

1

0.25

1

0.25

2.5

5

100

2

0.5

2

0.5

5

6

200

4

1

4

1

10

1

125

0.05

2

250

0.1

3

500

0.2

4

750

0.3

5

1000

0.4