RT-PCR 没有产物怎么办？

展源 0 2023-05-16

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RT-PCR 没有产物怎么办？

RNA被降解

在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA。使用良好的无污染技术分离RNA。在将组织从动物体取出后立刻处理。在100％甲酰胺中储存RNA 如果使用胎盘 RNase 抑制剂，不要加热超过45℃ 或pH超过 8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8 mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。

RNA中包含逆转录抑制剂

通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25 μg 到 0.4 μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。

逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

多糖同RNA共沉淀

使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火。确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。

起始RNA量不够

增加RNA量。对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用 0.1 μg到 0.5 μg乙酰BSA。

RNA模板二级结构太多

将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。

注意：不要在＞60℃ 时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb 的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。不要在高于37℃时使用 M-MLV。如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。

引物或模板对残余的RNA模板敏感

在PCR前用RNaseH处理。靶序列在分析的组织中不表达尝试其他靶序列或组织。PCR没有起作用对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物

PCR引物设计太差

避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计 Tm类似的引物。DNA含有抑制剂诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制TaqDNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀 DNA。

富含GC的模板对于GC含量＞50％的模板，使用PCRxEnhancer Solution。模板浓度太低使用 10^4 拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。

镁离子浓度太低从1mM到3mM，间隔0.5mM 进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM 到5 mM的镁离子浓度。

退火温度太高使用公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。

内容来源：Super Lab

责任编辑：展源

审　　核：何发

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