qPCR的常见问题

张明 0 2023-11-08

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在我们日常时，引物和试剂都是大家验证过的，可偏偏会跑的奇奇怪怪，也无法找到问题所在。那么该如何才能拿到自己的梦中情图呢？

qPCR 答疑

扩增曲线的荧光信号值低的原因是什么？

扩增曲线存在问题时，首先应确认基线校正或 ROX 校正前的原始曲线，扩增曲线的荧光信号值低多数是由于背景荧光信号值过高造成的。使用嵌合荧光法进行检测时，背景荧光信号偏高大多数是由于模板量过高，染料嵌入到初始模板 DNA 中发出荧光造成的。使用荧光探针法进行检测时，背景荧光信号偏高大多是由于设计的探针质量差使淬灭基团的淬灭作用不充分、报告基团和淬灭基团的搭配不合理、探针的荧光标记效率低等原因造成的。

进行 Real Time PCR 实验时，需要做哪些确认工作?

1. 引物和探针的序列是否有错误？组合是否正确？

2. Total RNA 是否有分解的可能？

3. 各种试剂是否忘记加入？

4. PCR 条件和荧光检出步骤是否设定正确？

出现扩增曲线朝右下方下落现象的原因是什么?

1. 由于基线校正不恰当。确认设置的基线校正范围的参数，按仪器说明书要求重新设定再进行解析。

2. 使用的模板量过多，扩增曲线过早起峰，使基线校正不能正常进行。当扩增曲线在 10 Cycles 以内起峰时，要将模板稀释 100～1,000 倍后使用。

如何选择制作标准曲线的标准品？

为了保持与实际检测样品间的扩增效率的一致性，作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。例如以基因组 DNA 为起始材料时就要选择基因组 DNA 作为标准品，进行 mRNA 表达解析时最好选择表达目的基因的 Total RNA（或以 Total RNA 为模板合成的 cDNA）作为标准品。

即使扩增碱基序列相同，但整体模板不同，也有可能导致 PCR 扩增效率不同（比如基因组 DNA 和质粒 DNA 等）。

使用什么方法来验证 qPCR 扩增产物？