第一法 金黄色葡萄球菌定性检验

1

操作步骤

·样品的处理 

称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~ 2min。若样品为液态,吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀。

·增菌 

将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18h~24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊 生长。 

·分离 

将增菌后的培养物,分别划线接种到 Baird-Parker平板和血平板,血平板36 ℃±1 ℃培养18h~ 24h。Baird-Parker平板36 ℃±1 ℃培养24h~48h。

·初步鉴定

金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm~3mm, 颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰 带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清 晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些, 且外观可能较粗糙,质地较干燥。

在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

·确证鉴定 

1.染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为 0.5μm~1 5 μm。 

2.血浆凝固酶试验:挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接 种到5mLBHI和营养琼脂小斜面,36 ℃±1 ℃培养18h~24h。

取新鲜配制兔血浆0.5 mL,放入小试管中,再加入 BHI培养物0.2 mL~0.3 mL,振荡摇匀,置 36 ℃±1 ℃温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现 凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌 菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI,36 ℃±1 ℃培养18h~48h,重复试验。 

2

结果报告

结果判定:符合4、5,可判定为金黄色葡萄球菌。

结果报告：在25g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。 

3

注意要点

1.7.5%氯化钠肉汤增菌培养：

（1）若样品本身在均质后清澈，培养18h观察呈现一定程度的浑浊（与培养前相比），则接种平板；若18h后仍无变化，继续培养至24h后无论浑浊与否都接种至平板；

（2）若样品本身在均质后浑浊，则直接培养至24h后再接种平板。

2.血平板：36±1℃培养18h后观察，若有菌落生长或有菌落生长的迹象（无论是否溶血），则应酌情配制NA、BHI并分装至小试管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、灭菌后NA应斜放凝固成琼脂斜面备用。至血平板培养至24h取出，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，同时挑取菌落接种至NA斜面、BHI肉汤管，36±1℃培养24h。

3.接种原则：

（1）革兰氏染色后还剩余10个或10个以上菌落，则NA、BHI分别接种5管；

（2）若多于5个（不包括5个）不足10个，则BHI接种5管，剩余的接种NA；

（3）5个及以下则全部接种BHI，不接种NA。

4.BP平板：

36±1℃培养24h后观察，有菌落生长则取出，无菌落生长则继续培养至48h后再观察。若血平板已挑取菌落进行证实试验，则不必再挑取BP平板上的菌落进行实验。若血平板上无菌落生长，则应在24h～48h内逐步观察BP平板是否长菌或有无长菌迹象，有则需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落进行纯化、增菌，36±1℃培养24h。 

5.血浆凝固酶试验：

（1）根据BHI管数，取冻干血浆粉，每瓶用移液枪加入0.5mL生理盐水，使其充分溶解，再换移液枪枪头取0.3mLBHI培养物加入其中（每管BHI用1个枪头），振荡摇匀后于36±1℃培养，计时，每30min观察一次，如呈现凝固（将试管倾斜或倒置时出现凝块）或半凝固（一般的液体呈现凝固）则判定为阳性。若一直不凝固，则一直观察，直至观察至6h（查看12次）还未凝固，则试验终止，判定为阴性结果；若中途出现完全凝固或半凝固，则试验终止，判定为阳性结果。

（2）同时取金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌悬液后作为阳性对照、以灭菌生理盐水为阴性对照，分别接种至BHI中同步培养后进行血浆凝固酶试验。

（3）若血浆凝固酶试验结果可疑，则挑取NA上的菌落接种BHI再次进行试验。

第二法 金黄色葡萄球菌平板计数法

1

操作步骤

·样品的稀释 

1.固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯 内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍 击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。 

2.液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形 瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。 

3.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL磷酸盐 缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。 

4.按3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管或 吸头。

·样品的接种  

根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进 行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别 加入三块 Baird-Parker平板,然后用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如 Baird-Parker平板表面有水珠,可放在25 ℃~50 ℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。  

·培养  

培养 在通常情况下,涂布后,将平板静置10min,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36 ℃±1 ℃培 养1h;等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于36 ℃±1 ℃培养24h~48h。 

·典型菌落计数和确认

1.金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为 2 mm~ 3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一 清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈 和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅 些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。 

2.选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU~ 200CFU 之间的平板,计数典型菌落数。

3.从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验。分别做染色镜检,血浆凝固酶试验;同时划线接种到血平板36℃±1℃培养18h~24h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌 菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。 

2

结果计数

1.若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU~200CFU 之间,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。 

2.若最低稀释度平板的典型菌落数小于20CFU,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。

3.若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU,但下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释 度平板上的典型菌落,按式(1)计算。

4.若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU,而下一稀释度平板上虽有 典型菌落但不在20CFU~200CFU 范围内,应计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。 

5. 若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20CFU~200CFU 之间,按式(2)计算。 

计算公式

3

结果报告

根据上面的公式计算结果,报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌数,以 CFU/g(mL)表示;如T 值为 0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。 

4

注意要点

1.取1mL样品稀释匀液接种3个BP平板（此处并未严格按照标准中0.3mL、0.3mL、0.4mL精确取样，由于如此操作会增加试验时间，无法在15min内完成试验）。

2.涂布时不要触及平板边缘（会导致样液涂抹不均匀，大部分汇集于边缘）。

3.可用同一根涂布棒从低稀释度到高稀释度进行涂布（不用换涂布棒）。

4.涂布完成后应稍微放置一段时间使培养基吸收样品匀液。

5.若水珠较多，可正置于培养箱中1～2h后再倒置培养。

6.36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数法

1

操作步骤

同第二法

2

接种培养

1.根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行 10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种 1 mL 样品匀液至 7.5% 氯化钠肉汤管(如接种量超过 1mL,则用双料7.5%氯化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物36℃±1℃培养,18h~24h。 

2.用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于Baird-Parker平板36℃±1℃培养,24h~48h。

3

典型菌落确认

同第二法

4

结果报告

根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数,查MPN检索表,报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数,以 MPN/g(mL)表示。

5

注意要点

1、样品稀释同菌落总数，取3个连续稀释度稀释液（或包括液体样品原液），每个稀释度接种3管7.5%氯化钠肉汤，每管接种1mL，36±1℃培养18h后观察，若出现浑浊则接种至BP平板，若无变化则继续培养至24h后再接种至BP平板。

2、划线接种至BP平板，36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

3、根据证实后的阳性管数差MPN表得出结果。