方法开发 | 方法转移的验证方案 -

方法开发 | 方法转移的验证方案

张明 0 2025-02-07

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液相色谱检出限

方法转移的验证方案

准确度

与标准品比较
对于被测物(例如纯药品物质)样品基质不复杂的情况，用直接与参比标准品比较确定准确度的技术较好。如果该被测物的定量测定很不很特殊,可由外界来源获得合格的标准品,如美国国家标准品与技术研究所(NIST)或专营参比标准品的供应商。确定一个 HPLC方法的准确度至少应用三种浓度(包括各样品的分别称重与制备),最少应进行九次测定。
加标回收
如果用HPLC方法测定复杂基质中的被测物,可使用回收测定法。该方法仍需用经良好特性鉴定的标准品,但实验是在有基质的条件下进行。因为基质中的其它组分可能干扰分离、检测及被测物的准确定量,必须研究基质组分的潜在影响。通过与已知的加入量比较来确定每种含量的回收率。定量分析主成分时,掺人量一般应为正常分析中被测物期望含量的5075、100、125和150%。各含量样品至少应重复测定三次。用其它掺入浓度系列也可以(如75、100、125%或80、90、100、110和120%)但关键是应包括最终产品的期望浓度。应进样分析该空白基质,以确定基质的背景影响(如果有的话)。
标准品加入法
标准品加入法是将不同(但已知)量的被测物掺人已含一些(未知量)被测物的基质中。然后可通过计算得出原样品中的被测物浓度。一般对于标准品加入法来说,不同实验中较好的方法是在基质中加入被测物期望浓度的25、50和100%。未加标准品的样品与每一份加了标准品的样品都应进行分析(通常重复三次),并将测得量与加入量作图分析。当难以制备或不可能制备适宜的不含被测物的空白基质时(例如分析普通血样中的胰岛素，其中总会含有背景浓度的胰岛素)，则使用这种方法。

精密度

国际协调会(ICH)提出的更全面的定义“将精密度分为三种类型:(1)重复性;(2)中间精密度;(3)重现性。

重复性
通过依次重复进样分析同一均匀样品(一般为10次或10次以上),并平均峰面积或峰高值,以确定全部进样的相对标准差(RSD),可测出该精密度。
中间精密度
中间精密度指在同一内多次使用同一方法时，全部测定结果(包括标准品)的一致性。其中包括不同日期、仪器或被测物的全分析,也包括多次配制的样品和标准品。
重现性
检验间的精密度，往往在协作研究或方法移植实验中进行测定。

线性

大多数方法,尤其是定量分析主成分时,其线性相关系数大于0.999即可。线性差于此值的方法可能得视为非线性，必须用更复杂的多点校正法或非线性响应模式。

如测定的响应值超过一个或多个数量级时,决定线性的最小二乘法则有严重缺陷。低浓度或高浓度的数据能对斜率、截距和相关系数有不良影响。斜率或截距计算值的微小变化能导致估测样品真值时出现误差。因此需要评价线性的更好方法。图15-2所示为在较宽浓度范围确定线性方法的一种通用的高级方法”。该方法包括在各测定浓度测定响应因子,将该响应因子(或灵敏度)对被测物浓度(或范围宽时的对数浓度)作图。响应因子可由下式计算

线性数据可由几种方式得到。一种简便技术是配制(较浓的)被测物储备液,进行系列稀释(如1→5,1→10,1→20),以得到所需的被测物浓度。系列稀释法有助于避免独立配制几种浓度带进的潜在误差。至少用不同的储备液重复此步骤三次，可得到三整套线性和响应因子曲线图(如图15-1~15-3所示),可用于测定线性的重现性。另外,进行这些线性研究最好用至少5种不同浓度进行实验

范围

美国药典(USP)含量均匀度项下规定单值偏离目标值可多达25%，仍可判为合格。因此，尽管期望的定量分析能在±5~10%的目标值范围内，一个慎重的线性论证应包含至少:25%的范围。

检出限、定量限

检出限LOD往往取决于其信噪比(S/N')，一般为2或3。我们推荐以S/N’比值为3作为HPLC 方法的检测限。

定量限(LOQ)可定义为响应值能准确定量的被测物的最小浓度。LOQ也可定义为精密度低于一定值(如RSD>3%)时的浓度。如果方法要求在最低检测浓度时达到一定的精密度,往往使用LOQ。L0Q的大小可任意设定,如S/N'=10。

不同系统和检测器,或使用被污染的试剂将导致S/N’比值发生较大变化(尤其影响基线噪音和漂移)。

专属性

测试所有可能的干扰化合物以证明它们都能与检测物峰分离,并达到规定的分离度(通常Rs≥2)。
使用选择性检测器,特别是对共流出的化合物。例如，选择性检测器(如电化学或放射性)只对某些化合物有响应,而对另一些则无响应。就放射性化合物来说,即使有组分与其完全重叠,但只要不具放射性,检测器就只“检测到"该有关化合物。这种情况下,尽管色谱分离不足,也能准确测定该化合物。
已建立方法的专属性往往很难保证。不过,在方法论证实验中能使用许多技术,以增加方法专属性的可信度。这些技术包括:
1掺入已知干扰物
2 样品降解研究
3 峰收集后,再用其它技术对其分析
4 专用在线检测,如LC/MS 或多波长扫描
5使用另一种色谱分离模式
6改变该HPLC方法的条件(如改变溶剂或梯度斜度

普适性

检测不同的影响(制造商和型号相同)或不同中应用该方法的影响。一个方法的真实普适性往往只有通过不同一段时间的验证才能确定。然而,随着对方法普适性需求的增加需要有更全面的预测普适性的计划。

强健性

强健性最重要的方面是建立能预测分离参数变化对结果影响的方法。

国际协调会(ICH)6已将分析步骤的强健性定义为“方法被微小的、但有意的参数改变对结果影响的承受能力”。一种良好的办法为系统地改变方法中的重要参数,然后测定它们对分离的影响，例如,如果一个方法使用36%ACN/水作流动相,那么用33、36与39%ACN/水进行分析,测定流动相对保留值和选择性的影响,则有助于确定有机溶剂含量比例变化对该方法的影响力。应对所有变量(如流动相添加剂、柱温、流速等)进行类似的研究。

稳定性
时间与温度对所有试剂与溶液的稳定性都很重要
标准品：批次，储存条件
样本：在机稳定性，自动进样器
流动相：选择流动相时应注意稳定性问题，特别是使用胺添加剂或特殊溶剂时。例如，已知含THF的流动相易被氧化。这些流动相应每天用 THF现配。有些缓冲液流动相也存在这类问题;例如，磷酸盐和醋酸盐为微生物生长的良好介质。在这类流动相中经常加人叠氮钠(0.1%)，以抑制微生物的生长;添加5%以上的有机溶剂也能奏效。
：即使最好的HPLC柱，最终也会降解并丧失其原有的性能，其程度往往与样品的进样次数有关。

系统适用性
美国药典(USP)规定了能在分析之前测定系统适用性的参数。这些参数包括理论板数(N)、拖尾因子、k或α、分离度(R,)和重复进样时峰高或峰面积的相对标准偏差(RSD)。一般来说,任何一种方法在验证系统适用性时,至少需用其中的两个标准。
一般将同一种标准溶液五次重复进样分析的峰高或峰面积的RSD作为标准之一。一主成分的定量分析方法,其五次重复进样分析结果的 RSD值一般应小于1%。而痕量化合物的测定,例如杂质标准品在定量限或其附近测定时,较高的RSD(5~15%)也可接受。
另一种标准是测试色谱性能。只有一个峰(如用外标法测定)的情况下,使用塔板数和/或拖尾因子。对多于一个峰的色谱分离,如内标法测定或可能有许多峰的杂质法,则最好使用一些测定分离能力的因子如α或R,具体化合物的或k值的重现性也可以说明系统的性能。

内容来源：实用高效液相色谱法的建立网络

责任编辑：展源

审　　核：何发

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