成果介绍

（1）研究假设

我们研究了这样一个假设，即妊娠和哺乳期间的抑郁样症状和FLX抗抑郁治疗会影响母体粪便微生物组的组成和功能。使用母体脆弱性（MV）大鼠，因为早期生活压力在这些动物中产生抑郁样症状和粪便微生物群落组成的变化（图1（a））。6，42与此一致，我们观察到应激组（sMV）和对照组（cMV）之间的受孕前差异，sMV组显示出比cMV组更高的α多样性（补充图1a，t30 =-2.0709，p < .05）。这与操作分类单位（OTU）相对丰度的差异一致（补充图1b）。然后，在整个妊娠期和产后期间，sMV和cMV雌性动物每天接受FLX或Veh给药（图1（B））。每周收集粪便颗粒进行16 S rRNA测序，除测序外，还将一个子集用于靶向代谢组学分析（图1（B））。

（2）妊娠期和哺乳期有不同的粪便微生物特征

为了检查妊娠期和哺乳期是否具有不同的粪便微生物特征，我们首先分析了所有治疗组的16 S rRNA测序数据，包括微生物α多样性和群落结构。怀孕期间的α多样性高于哺乳期，如Shannon多样性指数所示（图2（a），t158 =7.5845，p < .0001）。通过评估加权的UniFrac距离来探索样品之间的系统发育结构的差异。主坐标分析（PCoA）显示妊娠期与哺乳期获得的样本之间存在分离（图2（B），PERMANOVA p = .001）。为了确定在妊娠和哺乳之间观察到的群落结构变化的细菌特征，使用称为随机森林的机器学习方法来分析cMV-Veh组的数据。这产生了一个包含属级28个OTU的模型，区分怀孕和哺乳。揭示了从妊娠到哺乳的微生物组组成的大规模重组，与结构重塑一致。特别是在拟杆菌目和梭菌目中，从怀孕到哺乳，OTU的相对丰度发生变化（补充图2a）。

（3）氟西汀治疗改变了抑郁样行为大鼠模型中妊娠和哺乳期母体粪便微生物特征

为了测试早期生活压力、FLX及其组合是否会改变观察到的妊娠和哺乳期粪便微生物特征，我们首先比较了各组的α和β多样性指标。在怀孕期间，我们发现早期生活压力对微生物α多样性的主要影响，sMV组显示出比cMV组更高的Shannon多样性指数（图2（a），F1，60 =4.690，p <0.05）。事后分析显示组间无显著差异。在哺乳期，存在显著的FLX * 早期生活压力相互作用效应（图2（a），F1，92 = 5.256，p <0.05），并有压力主效应的趋势（F1，92 = 2.784，p = 0.0986）。事后分析显示，在哺乳期间，sMV-组的Shannon多样性指数显著高于cMV组（p <0.05）。在微生物群落结构方面，处理组基于加权UniFrac距离的PCoA分离（补充图2b，PERMANOVA p = .001）。特别是，在妊娠和哺乳期间，sMV-FLX组的微生物群落结构与sMV-Veh组的结构不同（图2（c），妊娠sMV-Veh vs sMV-FLX PERMANOVA p < .05，哺乳sMVVeh vs sMV-FLX PERMANOVA p =.001）。这表明，除了在妊娠和哺乳期间粪便微生物组的动态重构之外，在这些时期，氟西汀治疗调节sMV雌性中粪便微生物群的群落结构。接下来，检查了各给药组中构成区分cMV-Veh组妊娠和哺乳的随机森林生成模型的28个OTU的相对丰度。在全球范围内，治疗组中区分妊娠和哺乳的OTU模式与cMV-Veh组相似（图2（d））。然而，在妊娠期和哺乳期内，通过双向ANOVA（FLX * 早期生活应激）检测，特定OTU的相对丰度随给药而变化（图2（e）;补充图2c）。例如，对随机森林模型准确度贡献最大的2个OTU（类杆菌目的类杆菌和普雷沃氏菌）对FLX处理敏感。妊娠期间，FLX组的类杆菌相对丰度低于溶媒给药组（图2（e），FLX的主效应，F1，60 = 13.206，p <0.001）。事后检验显示，与cMV-Veh组相比，cMV-FLX组的类杆菌相对丰度更低（p <0.05）。在哺乳期，发现类杆菌相对丰度存在FLX * 早期应激相互作用的趋势（F1，92 = 3.774，p = .0551），sMVFLX组的相对丰度低于sMV-Veh组（p = .0764）。对于普雷沃氏菌，发现了相反的作用，FLX对妊娠期间普雷沃氏菌相对丰度的主要作用（F1，60 = 16.488，p < .001）。具体而言，cMV-FLX组中普雷沃氏菌相对丰度有高于cMV-Veh组的趋势（p = 0.0944），sMV-FLX组中普雷沃氏菌相对丰度在统计学上显著高于sMV-Veh组（p <0.01）。在哺乳期，发现FLX * 早期生活应激交互作用效应（F1，92 = 8.520，p < .01），以及FLX的主效应（F1，92 = 4.249，p < .05）。事后检验显示，与sMV-Veh组（p <0.01）和cMV-FLX组（p <0.05）相比，sMV-FLX组中普雷沃氏菌的相对丰度更高，达到几乎25%的相对丰度。同样，妊娠期间FLX对瘤胃球菌相对丰度有主要影响（F1，60 = 26.166，p <0.0001），其中cMVFLX组相对于cMV-Veh组（p <0.05）以及sMV-FLX组相对于sMV-Veh组（p <0.001）具有较高的瘤胃球菌相对丰度。在哺乳期，发现FLX * 早期生活应激相互作用（F1，92 = 4.245，p <0.05），并发现FLX的主效应趋势（F1，92 = 3.575，p = 0.0618）。事后分析显示，与sMV-Veh组相比，sMV-FLX组的瘤胃球菌相对丰度更高（p <0.05）。早期生活应激本身没有像FLX那样显著的影响，尽管在妊娠期间，应激母鼠中Adlercreutzia和UC拉赫诺螺旋菌科的相对丰度高于对照组，乳杆菌的相对丰度低于对照组（补充图2c）。考虑到社区内OTU表现出共现和共排关系，43我们进行了相关性分析，以查看样本中的这些关系，而不考虑采样或治疗的时间。28个所选OTU之间的相关矩阵显示，普雷沃氏菌与主要由梭菌目和脱硫弧菌目组成的菌群呈负相关（补充图2d）。瘤胃球菌属是梭菌目中的例外，与普雷沃氏菌属呈正相关。总之，这些结果证实了妊娠和哺乳在粪便微生物群多样性和组成方面是不同的。尽管早期生活压力增加了哺乳期的α多样性，但早期生活压力单独对微生物群落结构或对由我们的随机森林模型产生的OTU GUT微生物739的相对丰度的影响有限。然而，FLX影响了怀孕和哺乳期间的群落结构，以及因其区分怀孕和哺乳的能力而选择的许多OTU的相对丰度。FLX结合早期生活压力对母体微生物组的影响最大。

（4）妊娠期和哺乳期有不同的粪便代谢特征

细菌群落代谢和合成许多对母体和后代都至关重要的代谢物。细菌群落组成和预测功能的变化可能表明这些群落合成或代谢这些代谢物的能力发生了变化。我们首先对OTU数据进行了PICRUSt预测分析，以探索妊娠和哺乳的功能潜力不同的假设，因为它们具有不同的微生物特征。为此，对来自cMV-Veh组的PICRUSt生成的数据进行随机森林分析。在妊娠和哺乳期间，9种KEGG途径发生了显著变化，包括赖氨酸生物合成途径;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径;精氨酸和脯氨酸代谢途径（图3（a）;补充图3a）。总体而言，与氨基酸合成和代谢相关的途径是最能表征妊娠期与哺乳期母体细菌群落预测功能差异的代谢途径之一。为了确定微生物组的这种改变的预测代谢能力是否与实际代谢物可用性相关，我们测量了先前用于16 S rRNA测序的粪粒亚组（妊娠和哺乳期每组N= 4-5）中氨基酸、胆汁酸和短链脂肪酸的浓度（补充表1）。与微生物组结果相对应，主成分分析（PCA）揭示了在妊娠期间与哺乳期间获得的样品之间的代谢谱的明显区别（图3（B），上图）。为了揭示妊娠和哺乳期的代谢特征，对cMV-Veh组的代谢物数据进行了随机森林分析。在所得模型中纳入了14种代谢物，以区分妊娠期和哺乳期（补充图3b）。其中大部分是氨基酸，14种代谢物中有11种在妊娠期的浓度高于哺乳期（图3（c））。例如，氨基酸异亮氨酸和蛋氨酸在妊娠期间的浓度高于哺乳期间，而脯氨酸浓度在哺乳期间高于妊娠期间（补充图3c）。胆汁酸脱氧胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸的浓度在妊娠期均高于哺乳期。在随机森林模型中的短链脂肪酸中，异己酸浓度在妊娠期间非常低，而异戊酸浓度在哺乳期间很低。总的来说，代谢组学结果与微生物组发现和预测功能分析一致，可以区分妊娠和哺乳，并指出氨基酸是这种转变的核心。

（5）在抑郁样行为大鼠模型中，氟西汀治疗改变了妊娠期和哺乳期母体粪便代谢物的利用率

为了研究早期生活压力、FLX及其组合是否会影响上述cMV-Veh组中观察到的妊娠和哺乳期粪便代谢特征，我们比较了这些组的预测和测量代谢数据。早期生活压力和FLX对预测途径丰度的影响是混合的，sMV-FLX组通常具有这些代谢途径的最低预测丰度（图3（a））。基于代谢物浓度表的PCA图的目视检查显示早期生活应激或FLX处理无明显影响（图3（B），下图）。接下来，检查了处理组中随机森林生成的区分cMV-Veh组妊娠和哺乳期的模型中包含的14种代谢物的浓度。与微生物组结果相似，所有组中妊娠和哺乳期间代谢物利用率变化的总体模式相似（图3（c））。然而，粪便氨基酸浓度受到FLX处理的影响（图3（d），补充图3c）。在妊娠期间，FLX对天冬氨酸浓度的影响趋势为降低（图3（d），补充图3c）。FLX对妊娠期天冬氨酸浓度的影响呈趋势性下降（F1，16 = 4.090，p = .0602），对哺乳期天冬氨酸浓度的影响呈显著性主效应（F1，16 =9.689，p < .01）。在哺乳期，天冬氨酸浓度也有降低生活压力的趋势（F1，16 = 3.868，p = 0.0668）。组间事后分析显示，相对于sMV-Veh组，sMV-FLX组的天冬氨酸浓度显著较低（p < .05）。对于丝氨酸浓度，我们发现FLX * 在怀孕期间的早期生活压力相互作用效应（F1，16 =5.868，p < .05），以及FLX的主效应（F1，16 = 25.314，p < .001）。特别是cMVVeh组中丝氨酸浓度有低于sMV-Veh组的趋势。

由于仅限于随机森林鉴定的代谢物，我们可能会错过治疗对妊娠期和哺乳期代谢物的有趣影响，因此我们决定在妊娠期和哺乳期内也使用双向ANOVA分析这些代谢物（补充图3d）。我们发现FLX与哺乳期谷氨酸浓度较低（F1，16 =8.200，p < .05），以及妊娠期胆汁酸β-尿酸（F1，16 = 5.543，p < .05）和ω-尿酸（F1，16 = 7.002，p < .05）水平较低相关。有趣的是，在短链脂肪酸中，异丁酸浓度在妊娠期间（趋势，F1，16 = 3.952，p = 0.0642）和哺乳期间（F1，16 = 5.902，p <0.05）被FLX降低，而丁酸在哺乳期间被FLX增加（F1，16 = 5.019，p <0.05）。接下来，我们使用代谢物集富集分析（MSEA）来鉴定在妊娠或哺乳期间富集的粪便代谢物集。在cMV-Veh组中，这两个阶段之间存在几种显著不同的途径，同样包含氨基酸相关途径，如甘氨酸和丝氨酸代谢（图3（e）;补充图3e）。然后，我们对sMV-Veh、cMV-FLX和sMV-FLX数据进行MSEA，以确定哪些参与特定代谢过程的代谢物在妊娠或哺乳期富集。相比之下，在cMVFLX和sMV-FLX组中，未发现妊娠期和哺乳期之间存在显著差异的代谢物组。因此，在我们的母体抑郁样症状模型中，氟西汀治疗降低了妊娠和哺乳期动态期间几种关键氨基酸的粪便浓度。此外，氟西汀治疗消除了在Veh治疗组中观察到的MSEA鉴别途径的差异，这些途径区分了妊娠期和哺乳期的粪便代谢组。

（6）粪便细菌类群的相对丰度与代谢物浓度相关

最后，我们生成了一个相关矩阵，以进一步探索微生物组的组成与代谢物可用性之间的联系（图4）。我们在该分析中折叠了所有治疗组，以捕获OTU丰度和代谢物浓度的全范围变化。由梭菌目（包括UC消化球菌科、梭菌属、其他和示波螺旋体）和脱硫弧菌目（脱硫弧菌和UC脱硫弧菌科）的OTU组成的聚类与氨基酸浓度呈正相关。普雷沃氏菌的相对丰度与异丁酸和氨基酸（丙氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和丝氨酸）的可利用性呈负相关，几乎与此相反。与一组不同的代谢产物相关，瘤胃球菌的相对丰度与天冬氨酸和一些胆汁酸（β-尿苷酸、ω-尿苷酸和α-尿苷酸）的浓度呈负相关。总体而言，相对丰度受FLX处理影响最大的OTU（类杆菌、普雷沃氏菌和瘤胃球菌）与氨基酸可利用性相关。

● 创新性/应用前景