当进样之后，分离过程就在 里开始发生，被分离的样品成分相继离开（洗脱或者清洗出） ，然后到达检测器，常用的检测器有紫外可见光检测器(UV)或者质谱(MS)检测器。有分离的“模式”或本质最终主要取决于 的选择。

对于样品分析来说，目前最常用的HPLC模式是反相色谱法(RPC), 这个模式的典型特征是一根非极性的 加上水和有机溶剂组成的混合液作为流动相。我们假设溶剂的组成都是保持不变的，我们称之为等度洗脱，与之相反的是梯度色谱，梯度色谱的溶剂组成在分离过程是特意发生改变的

的结构

是一根圆柱形的管子，通常以微小的球形颗粒（直径大小通常为1.5~5μm)填充（图 2-2a)。这些颗粒在大多数情况下为多孔的硅胶颗粒，图2-2b 把颗粒上的每个孔描绘成一个直径固定的圆柱体（一般来说，用孔径为 10nm的颗粒分离“小分子”样品，即分子量 <1000Da)。每个孔的内部覆盖有固定相——在这个例子里，Cx官能团附着在硅胶颗粒上。图2-2c展示的是一个更加贴近目前使用的 HPLC的多孔颗粒。这些颗粒是通过把小的、半圆形的次颗粒结合在一起形成的。

由于颗粒的大部分表面是由这些孔构成的，因此大多数的样品保留在这些颗粒里面而非颗粒的表面上。也就是说，孔的内表面积占颗粒的总表面积的>>99%；大多数情况下，颗粒外表面积（及其对分离效果的影响)可以忽略不计。当流动相流过 的时候，它把每个颗粒都包围起来，而样品分子则通过扩散进入颗粒中的孔内（通常只有很少量的流动相流过颗粒）。

样品分离的过程

图2-3假定了一个含有三种不同化合物（或溶质）的样品的分离，每种不同的化合物分子分别用·代表溶质 X，□代表溶质 Y， ▲代表溶质 Z。为了能表达清晰，图中没有显示流动相的分子，溶解样品所用的溶剂分子用+代替。

样品进样到图2-3a的 上，并由流动相带动，在连续的不同阶段内流过 （图2-3b-d)，然后，样品最终离开 （图2-3e)进入检测器，并生成一个检测器响应对时间作图的结果（也就是色谱图，或者分离结果的记录）。

当色谱分离在图2-3a~d中继续进行时，样品成分X、Y和Z的分子展示出两种特征行为：差异移动(differential migration)和分子扩散(molecular spreading)。到了图2-3e，溶质分子X、Y和Z在 里就彼此分离开了。

差异移动与分子扩散

差异移动（溶质分子X、Y和Z以不同的速度移动并通过 )形成了色谱分离的基础。假如两个化合物分子没有移动速度的差异，它们之间就不可能发生分离。在这个例子中，样品分子X(•)移动最快，样品分子Z(▲)移动最慢：样品溶剂分子或者流动相并没有被 的填料所保留，它们都迅速通过了 ，并首先离开了 。进样样品里面的溶剂分子在图2-3b~e中以+表示。

当一个给定的溶质分子通过 时，这些分子迅速扩散开来，因而能占据 里大部分的体积。给定溶质的分子在 里所占的体积被定义为色谱带。这个溶质分子-体积的宽度是在液流的方向上测量的，并定义为带宽。对于溶质X， 它的带宽在图2-3a-d中以X(•)旁边的箭头和括号表示。

当色谱带离开 时，它就在色谱图中被记录下来（图2-3e)，被称为色谱峰。每个色谱峰的身份可以由它们通过 的时间来定义（保留时间)，而样品中每个溶质分子的浓度则和色谱峰的大小成正比。当样品的量足够小（很低的ng或者μg的进样量，作为HPLC含量分析里常用的进样量)，色谱峰的保留时间不会根据样品浓度（和所产生的峰的大小尺寸)的改变而改变。

色谱分析的过程

HPLC 系统的结构图可以在图2-1中看到，重点展示了溶剂（图中实线）从储液瓶流向检测器的路线（溶剂通常是指流动相或者洗脱液）。

当进样之后，分离过程就在 里开始发生，被分离的样品成分相继离开（洗脱或者清洗出） ，然后到达检测器，常用的检测器有紫外可见光检测器(UV)或者质谱(MS)检测器。有分离的“模式”或本质最终主要取决于 的选择。

对于样品分析来说，目前最常用的HPLC模式是反相色谱法(RPC), 这个模式的典型特征是一根非极性的 加上水和有机溶剂组成的混合液作为流动相。我们假设溶剂的组成都是保持不变的，我们称之为等度洗脱，与之相反的是梯度色谱，梯度色谱的溶剂组成在分离过程是特意发生改变的。

的结构

是一根圆柱形的管子，通常以微小的球形颗粒（直径大小通常为1.5~5μm)填充（图 2-2a)。这些颗粒在大多数情况下为多孔的硅胶颗粒，图2-2b 把颗粒上的每个孔描绘成一个直径固定的圆柱体（一般来说，用孔径为 10nm的颗粒分离“小分子”样品，即分子量 <1000Da)。每个孔的内部覆盖有固定相——在这个例子里，Cx官能团附着在硅胶颗粒上。图2-2c展示的是一个更加贴近目前使用的 HPLC的多孔颗粒。这些颗粒是通过把小的、半圆形的次颗粒结合在一起形成的。

由于颗粒的大部分表面是由这些孔构成的，因此大多数的样品保留在这些颗粒里面而非颗粒的表面上。也就是说，孔的内表面积占颗粒的总表面积的>>99%；大多数情况下，颗粒外表面积（及其对分离效果的影响)可以忽略不计。当流动相流过 的时候，它把每个颗粒都包围起来，而样品分子则通过扩散进入颗粒中的孔内（通常只有很少量的流动相流过颗粒）。

样品分离的过程

图2-3假定了一个含有三种不同化合物（或溶质）的样品的分离，每种不同的化合物分子分别用·代表溶质 X，□代表溶质 Y， ▲代表溶质 Z。为了能表达清晰，图中没有显示流动相的分子，溶解样品所用的溶剂分子用+代替。

样品进样到图2-3a的 上，并由流动相带动，在连续的不同阶段内流过 （图2-3b-d)，然后，样品最终离开 （图2-3e)进入检测器，并生成一个检测器响应对时间作图的结果（也就是色谱图，或者分离结果的记录）。

当色谱分离在图2-3a~d中继续进行时，样品成分X、Y和Z的分子展示出两种特征行为：差异移动(differential migration)和分子扩散(molecular spreading)。到了图2-3e，溶质分子X、Y和Z在 里就彼此分离开了。

差异移动与分子扩散

差异移动（溶质分子X、Y和Z以不同的速度移动并通过 )形成了色谱分离的基础。假如两个化合物分子没有移动速度的差异，它们之间就不可能发生分离。在这个例子中，样品分子X(•)移动最快，样品分子Z(▲)移动最慢：样品溶剂分子或者流动相并没有被 的填料所保留，它们都迅速通过了 ，并首先离开了 。进样样品里面的溶剂分子在图2-3b~e中以+表示。

当一个给定的溶质分子通过 时，这些分子迅速扩散开来，因而能占据 里大部分的体积。给定溶质的分子在 里所占的体积被定义为色谱带。这个溶质分子-体积的宽度是在液流的方向上测量的，并定义为带宽。对于溶质X， 它的带宽在图2-3a-d中以X(•)旁边的箭头和括号表示。

当色谱带离开 时，它就在色谱图中被记录下来（图2-3e)，被称为色谱峰。每个色谱峰的身份可以由它们通过 的时间来定义（保留时间)，而样品中每个溶质分子的浓度则和色谱峰的大小成正比。当样品的量足够小（很低的ng或者μg的进样量，作为HPLC含量分析里常用的进样量)，色谱峰的保留时间不会根据样品浓度（和所产生的峰的大小尺寸)的改变而改变。

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