液相 7大经典问题！

展源 0 2023-06-21

点赞 0 收藏

分享到

液相

使用过液相的小伙伴应该都问过这样的问题吧：不同的实验应该选择什么规格的？如何提高的分离？等等，今天就和小析姐一起看看下面这些问题你都遇到过几个？

什么是反相柱、正相柱？

“反相”和“正相”的概念是液相色谱法早期提出的概念，当时键合相尚未出现，固定相被涂覆在载体表面，极易流失，为此科学家对流动相使用给出了合理的建议：流动相极性与固定液极性应具有较大差别，以减少固定液流失。固定相极性弱于流动相时的液相色谱法被称为反相色谱法，固定相极性强于流动相时的液相色谱法被称为正相色谱法。尽管目前键合相已成为主流，但这一概念在色谱方法开发、预测出峰顺序等方面具有重要意义。

由上面的介绍可知 具体的色谱方法、属于正相还是反相不仅取决于固定相极性，同时还取决于流动相极性 。C18（硅胶键合十八烷基硅烷）、C8（硅胶键合辛基硅烷）、PH（硅胶键合苯基硅烷）等，由于固定相极性极低，比目前已知的任何流动相的极性都要低，因而是标准的反相柱；

Silica（硅胶）、NH2（硅胶键合氨丙基硅烷）具有较高的极性，主要用于分离带有极性基团的化合物，所用流动相的极性通常低于这些固定相，因而是标准的正相柱。CN（硅胶键合腈丙基）的极性适中，当流动相极性超过CN时，它属于反相柱，反之则是正相柱。

规格对分析结果会产生何种影响？

内径决定载样量，载样量与内径的平方成正比；长度与塔板数成正比，与柱压成正比；粒径影响涡流扩散相，粒径越小涡流扩散相越小，柱效越高，粒径与柱效近似成反比；粒径越小，压力也越大，压力与粒径的平方成反比。填料孔径对分析对象的分子量有限制，当孔径为分析物尺寸的5倍以上时，分析物才能顺利通过孔隙，孔径处于60~120 Å的适用于相对分子量小于10000的分析物，孔径为300 Å的可以满足分子量处于10000以上的大分子化合物分析。

液相色谱分析中如何才能提高分离度？

下式为分离度计算公式：

N： 柱效(Efficiency)反映性能，柱效越高，分离度越好。 在其他条件恒定的情况下，塔板数增加一倍，分离度仅提高40%。操作中，可通过下面两种方式增加塔板数进而提高分离度：其一，使用长柱或双柱串联，但也会使分离时间大大延长；其二，使用细粒径填料的，但这需要耐更高压力的液相色谱系统。相比之下后者更为可取。

α： 选择性(selectivity)是指 -流动相体系分离两个化合物的能力。 选择性主要与固定相、流动相组成以及柱温等因素有关，与保留值也密切相关，其中固定相和流动相组成影响较大。

以最常见的反相模式为例，反相柱(包括C18、C8、PH等)是以分配作用对化合物进行保留的，不同化合物的分离是基于它们在键合相与流动相中分配系数的差异，如果两种化合物的水溶性、在烷烃-水体系的分配系数等方面存在明显差异，那么这些化合物通常是能够利用反相柱达到分离；PH柱对具有苯环的化合物具有特殊保留。

正相模式下，硅胶柱、胺基柱、氰基柱与带有极性基团的化合物之间存在极性相互作用，对化合物的基团具有选择性，常常用于结构类似物、异构体化合物的分离。流动相方面，降低流动相的洗脱强度通常可以增大分离度；而有机溶剂类型也会影响分离，比如反相条件下，乙腈和甲醇的选择性就存在很大差异，这种差异需要在实践中摸索，但无论如何，多种溶剂类型带给我们更多的实现分离的可能。

k： 随着容量因子k的增大，分离度也随之增加，这种影响在k值较低时非常明显， 当k值大于10时，k值增加对分离度的影响就不再显著，这就告诫无原则地提高k值以增大分离度是没有意义的。增加键合相密度能够提高k值；另外改变键合基团类型也能改变k值，比如在反相色谱中，随着键合相碳链长度的增加，k值逐渐增大。

何谓封端？封端的意义是什么？

硅胶表面的硅羟基(Si-OH)密度为8 μmol/m2，由于空间位阻的存在，硅烷化键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半的硅羟基是活性硅羟基。这些硅羟基与化合物的极性基团存在极性相互作用和离子交换作用，为化合物的保留增加了不被期望的作用力，往往会影响峰形。 用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小甚至消除这种影响，这种操作被称为封端(Endcap)。

封端处理的意义：

抑制了特异性吸附，提高了色谱峰的对称性，并改善了分离效果；

在一定程度上掩蔽了硅胶表面，使其对碱性环境的耐受性增强；

通过空间位阻掩盖了键合反应形成的Si-O-Si键，使其对酸性环境的耐受性增强；可能会影响对极性样品的选择性。

柱床塌陷和键合相塌陷

柱床塌陷是指使用一段时间后入口处的柱床产生可见的空隙。 该空隙的存在增大了死体积，会导致柱效下降。造成柱床塌陷的原因如下：

其一，填装时的压力过低，填装不紧密，在高压下使用一段时间，开始出现空隙；

其二，操作压力超出填料的耐压值，导致填料颗粒破碎产生空隙；

其三，流动相溶解填料导致空隙出现。键合相塌陷是指由于流动相极性与键合相极性相差太大，键合相无法在流动相中充分伸展而倒伏、缠结在一起，比如普通C18在纯水相条件下。相塌陷会导致对化合物的保留不足。

系统压力升高的原因及排除

使用者通过观察仪器的系统监测掌握系统的压力，如果发现压力偏高，不要立即认为“柱压高了”，因为 系统压力通常由柱前压力、压力和流通池压力加合而成 。此时正确的做法是：在操作条件下，测定系统压力，得到p总；卸下，在相同条件下，测定柱前压力，得到p前；用两通将泵流出管路与流通池连接，在操作条件下，测定压力，得到p(前+后)。通过计算找出压力高是来自柱前、还是柱后。