创新性采用自主研发的高效分离与检测体系首次对尿液中细胞外大囊泡（lEVs）进行了系统性蛋白质组学解析，揭示了一组用于无创鉴别前列腺癌（PCa)和前列腺炎的新型生物标志物，阐明了关键翻译后修饰（PTMs）的作用，并基于机器学习算法开发出适用于PSA诊断“灰区”的优效诊断模型。东南大学硕士研究生范钰萍和张雨婷、博士研究生张贵元和艾迪康公司马乐博士为共同第一作者。项目得到了国家、省市和高校等科研基金，以及南京江北新区生物医药公共服务平台的支持。

临床迷局｜癌与炎的“分子伪装”亟待破解

前列腺癌（PCa）是全球男性中发病率排名第二的常见恶性肿瘤，也是导致男性癌症死亡的主要原因之一，已成为严重威胁中老年男性健康的重大公共卫生问题。世界卫生组织（WHO）等机构反复强调，提高前列腺癌早期诊断的特异性、减少不必要的穿刺活检和过度治疗，是提升患者生存质量和优化医疗资源配置的关键。

在临床实践中，面对大量因PSA升高或下尿路症状就诊的男性，如何从中精准识别潜在的致命性前列腺癌患者，并与更为常见的前列腺炎区分开来，始终是阻碍前列腺癌精准诊疗的重大挑战。近期，美国总统拜登在年度体检中被诊断出前列腺癌，并接受了根治性前列腺切除术。这一事件再次将公众目光聚焦于前列腺癌的早筛早诊问题，也凸显了当前诊疗流程中“早期发现”与“过度治疗”之间的平衡困境。

令人振奋的是，来源于尿液的细胞外囊泡（EVs）作为前列腺局部微环境的“分泌指纹”，可携带肿瘤相关蛋白、RNA等生物分子，正在成为“液体活检”技术的重要突破口。与传统的组织穿刺相比，EVs分析具有非侵入、可重复、临床可及性强等优势，为更早、更准地识别恶性前列腺病变提供了全新的解决方案。

细胞外大囊泡｜被忽视的肿瘤信息“富矿”

细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞主动释放、具有脂质双层膜结构的纳米颗粒，按尺寸大小主要分为大囊泡（large EVs，lEVs，>200 nm）和小囊泡（small EVs，sEVs，<200 nm）两类。目前，关于sEVs在多种疾病中的生物学功能和临床价值已开展了大量研究，然而对lEVs的系统研究仍较为稀缺。

从生物发生机制与组成异质性来看，sEVs主要来源于多囊泡体（MVBs）与细胞膜融合后的外排，属于内向芽生过程；而lEVs则是直接通过细胞膜外向出芽形成，呈现出独立的生物生成路径。这种差异不仅决定了其分子组成和功能潜力的差异，也使得lEVs具备更大的直径和更丰富的内容物承载能力。

相较于sEVs，lEVs在空间结构上能够装载更多种类和更高丰度的蛋白质、脂质和核酸等信号分子，具备更强的跨细胞信息传递和肿瘤微环境重塑能力。因此，lEVs可能在肿瘤进展中扮演独特而关键的角色，与sEVs在功能上形成互补或形成差异化对照，代表了一类尚待充分开发的疾病生物标志物“富矿”。

技术突破｜融合经典技术与新兴手段，打造高效的lEVs蛋白质组研究策略

然而，传统的lEVs分离方法，如沉淀、超速离心和尺寸排阻色谱，普遍存在操作耗时、纯度不高和回收效率低等问题，严重制约了其在临床应用中的推广。针对这一难题，研究团队自主开发了一种集成式分离纯化策略，巧妙融合了功能化磁珠（EVtrap）、离心与膜过滤等技术手段，并结合独特的化学亲和机制，实现对脂质膜包裹的lEVs的高效捕获。该方法在保障操作简便性的同时，显著提升了lEVs的纯度与回收率（>95%）。进一步联用高通量质谱平台（MS），可在微量尿液样本中实现数千种lEV蛋白的精准鉴定，为深入解析lEVs的蛋白质组特征和发现潜在生物标志物奠定了坚实基础。

精准解码｜锁定驱动癌变的“关键分子开关”

研究团队利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统描绘了尿液中lEVs的蛋白质组谱，并结合MRM方法对筛选出的差异标志物进行严格验证。共鉴定出>3500种lEV相关蛋白，并进一步筛选出17种显著差异表达的关键蛋白（lEV-DEPs），其中12种在多组样本中表现出稳定的上调或下调趋势。值得关注的是，研究还发现特定的翻译后修饰在前列腺癌进展中可能发挥重要调控作用，揭示了其作为“分子开关”在驱动肿瘤恶性演化过程中的潜在机制。 

诊断优化｜机器学习模型整合lEV标志物提升灰区患者识别能力

研究团队基于随机森林（Random Forest）算法，构建了一个整合4个关键尿液lEV差异表达蛋白（lEV-DEPs）的诊断模型（P-DUSK），在前列腺癌识别中表现出优异性能，曲线下面积（AUC）为0.87，优于传统的单一PSA指标。进一步应用XGBoost算法分析表明，P-DUSK模型在PSA处于4–10 ng/mL的“灰区”患者中显示出更高的鉴别力，显著改善该人群中前列腺癌与良性病变的鉴别效率，为灰区患者的精准无创诊断提供了新的方法学支持。

起源探秘|lEV反映肿瘤细胞膜的分子特征

研究结果表明，lEVs在蛋白质种类和丰度分布上与细胞膜（CM）具有更高的相似性，相较于sEVs更能反映其起源特征。进一步的信号通路富集分析显示，lEVs所富集的生物学通路与细胞膜的功能谱系高度一致，提示其在分子水平上保留了肿瘤细胞膜特定时空状态的重要信息。这一发现从蛋白组学角度提供了lEVs膜性起源的证据，也为其作为前列腺癌等肿瘤早期无创标志物的开发奠定了坚实的生物学基础。

转化前景｜尿液lEV无创精准诊疗的新范式

该研究建立了一套高效、系统的尿液大囊泡（lEVs）蛋白质组学分析流程，首次全面阐明lEVs在前列腺癌（PCa）无创诊断中的关键价值，并开发出基于lEV特异性蛋白标志物的高性能PCa诊断模型。研究不仅为深入理解PCa的分子病理机制提供了新的视角，也为精准、早期、无创筛查提供了技术储备与方法支撑。

研究成果显著拓展了液体活检的适用范围，标志着EVs研究在向临床转化方面迈出了关键一步。尿液lEV检测有望作为前列腺特异性抗原（PSA）检测的重要补充，尤其适用于高风险人群的无创初筛与早期风险预警。该策略有助于实现前列腺疾病的分子分型与个体化管理，推动肿瘤液体活检技术在临床中的普及、简便与精准化。

参考文献：

Proteomic Profiling of Urinary Large Extracellular Vesicles for Diagnosis of Prostate Cancer. Analytical Chemistry, doi: 10.1021/acs.analchem.5c01320.