参数知多少？

张明 2025-09-28

现代高效液相色谱分析中，的选择直接影响了分离效果的好坏，选择合适的可以缩短方法开发所需的时间，并且使方法更具稳定性。但是现在市场上种类繁多，选择时哪些参数是我们必须考虑的呢？

参数

一、物理性质

柱管规格：即柱长和内径，如最常见的250*4.6mm。一般柱长在2—250mm，柱越长，分离度越高，但柱压更高，分离所需时间更长;但分离度与理论塔板数的平方根成正比，所以一昧增加柱长并不是最有效的分离手段，且要考虑实际柱压的影响。一般情况下，150mm、5um的填料可以提供足够的塔板数。
粒径：粒径能够影响色谱分离度。粒径越小，分离越快，柱效越高，但柱压力越高，柱容易被污染，导致柱寿命降低。常见分析柱通常使用5um填料，复杂的多组分样品分离一般使用3.5um粒径，更大内径的制备通常使用更大的粒径。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而，3.5um的的背压却是5um的2倍，因此如何选择填料粒径需要根据现实情况而定。

图1：相同倍数下1.7-10um填料（来源:纳微单分散微球）

3.孔径，60A，120A，300A等。孔径小，则含孔率高，比表面积大，载碳量高; 填料孔径大小需和分子大小相匹配，保证分子自由进出填料孔并与孔内表面的键合相进行分离分配，通常要求孔径直径是分子直径的3倍以上，一般小分子使用80—120A，大分子使用300A。

图2：孔径电镜图（来源：纳微单分散微球）

4. 填料颗粒形状，一般有球形和不规则形，当使用黏度较大的流动相时，球形颗粒可以降低柱压，延长寿命。一般HPLC 均为球形填料，在中低压制备领域仍在采用大量的无定性填料。

5.比表面积，指的是每克填料的表面积，如180m2/g—350m2/g，与粒度和含孔率有关;比表面积大，会增加样品与键合相之间的反应，增加保留和分离度;比表面积小则可以缩短分析时间和平衡时间，并不是比表面积大或者小就更好，需要选择合适的比表面积。

二、化学性质

硅胶基质：最通用的基质，强度大，化学修饰容易，但使用的pH值范围有限(一般为2—8，特殊修饰的可以达到1—12)。
聚合物基质：多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂，化学稳定，应用pH范围宽，具有更强的疏水性，对蛋白质等样品分离效果较好;但强度较小，有机溶剂可能导致聚合物溶胀而受损，批次重复性较差，商品化不多，一般价格较贵。
载碳量：基质表面键合相的比例，载碳量高，则保留增加，适合分析非极性化合物。
键合相：键合试剂不同，对化合物的选择性不同，一般长链的烷基键合相(C18 C8)比短链的(C4 C3)稳定;非极性的键合相比极性的键合相(-NH2)稳定。
封端：用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来，以减少残留的硅醇基，减轻待测组分与酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象。尤其对于极性样品而言，未封端处理的分离效果较差。
正相&反相色谱：目前市场上主要以反相色谱为主，约占80%的比例。

在了解了的基本知识后，的选择也就迎刃而解了。

柱长及内径的选择

　　长度的选择：柱越长，总柱效越高(n值越大)，柱越长，分析时间也越长。250—300mm是最普遍的柱长，一半以上的工作都是采用此规格柱子，一般用来分离l0到50个组份的中等至复杂混合物;500—600mm，要求较高分辨率的应用，—般用来分离大于50个组份或包含有难分离物质的复杂样品程序升温分析。

　　内径：柱效率与柱半径平方成反比，内径越小柱效越高，但内径越大，柱容量也增加，允许进样量就越多。当进样量超过柱容量时，则因柱内每块理论板内不能建立真正的平衡，将会导致色谱蜂畸变，柱分辨率降低，重现性不好。因此对于复杂样品需要精确分离，必须使用小内径柱子。另一方面若样品中存在具有很不相同浓度组份化合物，为了增加样品容量就必须使用内径大的柱子，目前使用最常见的柱子内径一般是4.6mm。

一般选择原则

分析大分子量化合物选择大孔径 ;

对于高pH值或者碱性化合物需要选择高封端或者特殊封端的，以改善峰形，延长使用寿命等。　

现在商品化的液相琳琅满目，根据的参数可以给我们提供一个初步的选择，但由于各个仪器厂商的填料技术和键合技术都有差异，即使都是C18柱，同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高温的、有适合碱性样品的等等。所以在选择前要好好研究参数，仔细阅读说明书，才能找到合适的和适宜的分离方法。

内容来源：食品微生物检测

责任编辑：展源

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