基质材料

1）硅胶

 硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。

硅胶的主要性能参数有：

①平均粒度及其分布。②平均孔径及其分布。与比表面积成反比。③比表面积。在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。④含碳量及表面覆盖度（率）。在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。⑥端基封尾。在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。⑦几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。

2）氧化铝

 具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。

3）聚合物

 以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗 。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在pH13下反复冲洗。

 所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料，其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合物基质中，因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质。

目前，化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应，形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。硅胶表面的硅醇基密度约为5个/nm2，由于空间位阻效应（不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上）和其它因素的影响，使得大约有40~50%的硅醇基未反应。

封端-碱性化合物拖尾

残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，特别是对非极性键合相，它可以减小键合相表面的疏水性，对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化（使溶质在两相间的平衡速度减慢，降低了键合相填料的稳定性。结果使碱性组分的峰形拖尾）。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称封端（或称封尾、封顶，end-capping），以提高键合相的稳定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其与水系流动相有更好的"湿润"性能。

含碳量

键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。

键合相的种类

构造

由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。

柱管

不锈钢

管壁效应：

即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽

降低管壁效应：

不锈钢柱内壁多经过抛光

不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度

柱填充工艺

硅胶的活性

主要影响碱性化合物的保留行为：k'，生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同，是选择性差异的主要来源，硅胶的杂质含量，重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小，是 质量好坏的重要标志

一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。

保存

短期

使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉 中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。

长期

对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新 时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。

1）反相柱的再生：依次采用20-30倍的 体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗 ，完成后再以相反顺序冲洗 。

2）正相柱的再生：依次以20-30倍 的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗 ，然后再以相反的顺序冲洗 。要注意上述溶剂必须严格脱水。

压力升高

原因

1） 头的过滤筛板堵塞或污染；

2） 头的填料被样品污染；

3） 内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；

4）流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解；

解决

1）如确定是 头的过滤筛板被污染，可以将 反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下 头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入 。

2）如确定 头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

3）如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗 使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

4）如果因pH值使用不当，很难恢复。

注意事项

①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动．温度的突然变化或者使 从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时的转动不能过缓（如前所述）．

②应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然．

③一般说来 不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去柱内的杂质．否则反冲会迅速降低柱效．

④选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏．有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶＂饱和＂，避免分析柱中的硅胶基质被溶解．

⑤避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱骨需要对样品进行预处理或者在进样器和 之间连接一保护柱．保护柱一般是填有固定相的短柱．保护柱可以而且应该经常更换．

⑥经常用强溶剂冲洗 ，清除保留在柱内的杂质，在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75ｍｌ。

正相硅胶柱以正已烷（或庚烷）｀二氯甲烷（或氯仿）和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使　硅胶表面重新活化。

反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动　相不含缓冲液，那么可以省略最后一步用水冲洗。一氯甲烷能洗支残留的非极性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混全溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1％）梯度洗能除去蛋白质污染。

阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇　、水依次冲洗。

⑦保存 时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

⑧ 使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。

通常 寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶。新的 在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降。 每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。

9.柱的保养：当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；

要注意流动相的脱气；

避免使用高粘度的溶剂作为流动相；

进样样品要提纯；

严格控制进样量；

每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；

每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；

若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；