一、 核心原理：

革兰氏染色并非简单地给细菌“上色”，其背后是基于细菌细胞壁结构根本性差异的精密化学原理。

关键在于“细胞壁”：

革兰氏阳性菌（G⁺）： 拥有一层厚实（20-80 nm）且致密的肽聚糖层（占细胞壁干重的50%-90%），如同一堵坚固的砖墙。这层肽聚糖网结构中还穿插着大量的磷壁酸。这种结构非常致密。

革兰氏阴性菌（G⁻）： 细胞壁结构复杂且薄。它只有一层很薄的肽聚糖层（2-3 nm），但在这层之外，还有一层至关重要的外膜。外膜由脂蛋白、脂质双层和脂多糖（LPS） 组成。

染色过程的化学博弈：

初染（结晶紫）： 所有细菌都被染成紫色，此时看不出区别。

媒染（碘液）： 碘与结晶紫结合，在菌体内形成不溶于水的结晶紫-碘复合物（CV-I Complex）。G⁺菌的厚肽聚糖网眼恰好能将这个大分子复合物“锁”在里面。

脱色（酒精或丙酮酒精）： 这是最关键、最需要技巧的一步。

对于G⁺菌：厚厚的肽聚糖层在脱色剂作用下会脱水、收缩，网眼变得更小，从而将CV-I复合物牢牢锁死在内，紫色无法被洗脱。

对于G⁻菌：脱色剂会溶解其外膜中的脂质成分，并破坏薄薄的肽聚糖层，形成孔洞。CV-I复合物很容易就从这些孔洞中被抽提出来，紫色褪去，菌体变得无色。

复染（沙黄或番红）： 作为一种对比色，将已经被脱色的G⁻菌染成红色或粉色。而G⁺菌由于依然保留着浓郁的紫色，不会被红色覆盖。

一句话总结原理：G⁺菌因细胞壁厚而致密，能保留初染剂的颜色；G⁻菌因细胞壁有外膜且肽聚糖薄，易被脱色从而染上复染剂的颜色。

二、 标准操作步骤（实操指南）

成功的染色依赖于严谨的操作。以下是经典的四步法：

1、涂片制备：

取菌：用接种环无菌取菌落（或液体培养基）少许。

涂片：在载玻片上用生理盐水乳化，涂成薄而均匀的菌膜。

固定：涂片自然风干后，快速通过酒精灯火焰2-3次（以玻片不烫手背为宜）进行热固定，目的是杀死细菌并使其牢固附着在玻片上。

2、初染（结晶紫）：

滴加结晶紫染液，覆盖菌膜，染色1分钟。

用细缓水流轻轻冲洗掉染液。

3、媒染（卢戈氏碘液）：

滴加碘液覆盖菌膜，染色1分钟。

用水轻轻冲洗。

4、脱色（95%酒精或丙酮酒精混合液）：

将脱色剂滴在玻片上，并轻轻晃动，直至流下的液体无明显紫色（此过程通常仅需数秒至20秒，是技术关键！）。

立即用水轻轻冲洗，终止脱色。

5、复染（沙黄或番红）：

滴加复染液，染色30秒至1分钟。

用水轻轻冲洗。

6、镜检：

用吸水纸轻轻吸干水分（勿擦拭），或自然风干。

在油镜下（1000倍）观察。

流程概览：涂片 → 固定 → 结晶紫（1min）→ 水洗 → 碘液（1min）→ 水洗 → 酒精（关键！）→ 水洗 → 沙黄（30s-1min）→ 水洗 → 吸干 → 镜检

三、 常见误区与注意事项（避坑指南）

许多初学者结果不理想，往往源于以下误区：

1、涂片太厚： 菌层过厚会导致脱色不完全，G⁻菌核心的紫色未被洗脱，可能被误判为G⁺菌。务必制成薄而均匀的菌膜。

2、脱色过度或不足：

过度脱色： 酒精作用时间太长，连G⁺菌的CV-I复合物也被洗脱，导致G⁺菌被染成红色，误判为G⁻菌。这是最常见的错误。

脱色不足： 酒精作用时间太短，G⁻菌的紫色未被洗掉，复染不上色，所有菌都是紫色，无法区分。

3、忘记碘液： 没有形成CV-I大分子复合物，染料极易被洗脱，导致全部菌染成红色。

4、水洗过猛： 强烈的水流冲击会冲掉菌膜，导致制片失败。

5、菌龄不当： 使用过于衰老的培养物（如培养超过48小时）时，部分G⁺菌的细胞壁可能受损、解体，失去保留结晶紫的能力，出现“革兰氏可变性”或假阴性反应。最好使用培养18-24小时的新鲜菌种。

6、玻片不洁： 玻片上的污渍会影响观察和判断。

四、 结果判读：

在油镜下，您需要观察颜色、形状、排列和比例。

判读技巧与特殊情况：

寻找典型视野： 不要只盯着一个地方，应多移动视野，寻找细菌分散、单个、染色清晰的区域进行判读。

“阴阳分明”： 在一个视野中，G⁺菌和G⁻菌的颜色对比应该非常鲜明。如果所有菌都呈现一种不蓝不红的模糊颜色，通常是脱色步骤出了问题。

注意假象：

杂质： 染料沉淀或其他杂质可能被误认为细菌，但其形状不规则，边缘不清。

革兰氏可变菌： 如某些芽孢杆菌、奴卡菌等，其染色性不稳定，可能在同一涂片上出现紫色和红色的混合。

中性粒细胞： 在临床标本（如痰、脓液）中，中性粒细胞的细胞核会被染成红色，胞质浅淡，不要与细菌混淆。

五、 临床与科研意义：为何历久弥新？

快速初步诊断： 在数分钟内，医生就能根据染色结果初步判断是G⁺菌还是G⁻菌感染，从而指导经验性用药（例如，首选针对G⁺菌的万古霉素或针对G⁻菌的头孢三代）。

评估标本质量： 在痰液标本中，通过观察鳞状上皮细胞和白细胞的数量，可以判断标本是否来自下呼吸道，还是被唾液污染。

纯培养物鉴定： 在细菌鉴定流程中，革兰氏染色是第一步，决定了后续生化试验的选择方向。

科研基础： 是研究细菌形态、结构、分类和抗菌药物作用机制的基础手段。

总结

革兰氏染色是一项将微观结构与宏观颜色联系起来的精巧实验。掌握它，不仅在于记住步骤，更在于理解其原理，并在无数次实践中磨练出对“脱色”火候的精准把握。它就像一把钥匙，为我们打开了通往细菌世界的第一扇大门。无论您是医学检验者、微生物学者还是学生，精通革兰氏染色，都将为您的专业之路打下最坚实的基石。